為促進全國PCR技術研發及應用人員進行技術交流，近日領航基因參加了由儀器信息網舉辦的第三屆“PCR技術前沿及應用”專題網絡研討會，并邀請廈門大學楊朝勇教授做專題報告，介紹數字PCR技術應用領域最新進展。

      數字PCR技術是近年來廣受關注的全新一代分子診斷技術，在本次研討會上也是各路學者大咖交流的熱點。楊教授以多重熒光數字PCR技術為切入點，為在線觀眾獻上了一場精彩的報告。由于時間關系，很多人可能沒有機會現場收看這次講課，現將楊教授報告中部分內容整理后與大家分享，共同學習。

      1983年美國科學家 Kary mullis提出聚合酶鏈式反應構想，開啟了“第一代”PCR技術的先河。但通過瓊脂糖電泳對擴增結果進行分析，存在著操作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風險大等缺點。90年代“第二代”熒光定量qPCR問世，在PCR擴增的同時對反應體系中的熒光信號進行實時收集，通過Ct值和標準曲線來分析結果，PCR技術實現了商業化發展。但依賴于Ct值只能獲得相對定量的結果，而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細微的條件下，其檢測的靈敏度、精確度都受到了限制。在這種背景下，“第三代PCR”-數字PCR技術應運而生，由于其獨特的技術優勢和應用前景，2006年后數字PCR技術產業化發展相當迅速。

      20世紀末，Vogelstein等提出數字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號通過泊松分布進行統計學分析。這一巧妙的設計使得靶分子的熒光信號可以在數萬個反應單元中一個一個直接“數出來”，實現了絕對定量。

      1. 單分子PCR擴增，大大提升了檢測靈敏度
      2. 無需標準曲線，直接給出絕對定量結果
      3. 消除擴增效率對Ct值的影響，檢測結果精密度穩定性高
      4. 適合復雜樣品檢測，不易受PCR抑制劑影響
      當一份樣本分散成20000個反應單元時，其靶基因豐度提升了330倍，相應的背景核酸與各種干擾物質的影響大大降低。這也是dPCR在檢測靈敏度和穩定性上大幅超越qPCR的關鍵原因。

      多種熒光修飾的探針及其引物組成不同的擴增體系，當數字PCR擴增體系中存在多個目標
      樣品時，最終能夠檢測到多種不同的熒光信號。
      多重熒光數字PCR特點：系統性、簡便性、高效性。

      隨著數字PCR技術的發展，目前核心技術已從高效穩定的液滴生成向多重熒光通道邁進，未來將走向全自動一體化。與國際主流產品相比，我國自主知識產權數字PCR系統已經在多重熒光通道檢測技術上取得領先，其中領航基因公司2018年獲得3通道熒光閱讀儀批文后，2019年其5通道熒光閱讀儀iScanner5獲得藥監局二類醫療器械注冊證，代表了當前多重熒光數字PCR技術的最高水平。后續開發方向有熒光通道的進一步擴展，以提升數字PCR的多重檢測效率，可以幫助臨床用戶從一份樣本中獲得更多的信息。在系統的自動化與集成化上，領航基因正在開發的全自動一體化數字PCR工作站，通過簡單幾步操作即可完成從核酸提取到數據分析的整個檢測流程，極大簡化人工操作步驟。

      領航基因多重熒光數字PCR系統由儀器平臺與配套芯片組成，整個檢測過程約兩個半小時，包含核酸純化、芯片上樣、PCR擴增、熒光掃描、數據分析幾個步驟。其中樣本液滴生成基于自主專利的油相配方和獨特的微流道設計，在封閉芯片內部快速生成均勻、穩定的單層平鋪液滴，確保樣本加載芯片后不再需要移液操作，最大程度避免人為操作帶來的交叉污染和樣本損耗。5色熒光由FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy7組成，可同時對32個樣本進行5通道檢測。

      數字PCR技術具有超高靈敏度、精準定量的優勢，使之尤其適合極微量核酸分子的定量檢測以及復雜樣本中的稀有突變檢測，在腫瘤、生殖健康以及微生物感染檢測方面具有非常好的臨床應用前景。多重熒光數字PCR，可以滿足臨床常見的多項指標聯合檢測需求，已成為近期的研究熱點。


      隨著數字PCR（digital PCR, dPCR）、二代測序（next generation sequencing, NGS）等方法的出現，定量檢測EGFR突變已經成為可能。多項臨床試驗證明，患者服用靶向藥物過程中，可選擇進行多次的動態監測血液中與藥效相關驅動基因的突變豐度，以提示藥物療效評估患者病情進展，在此領域的應用中，高靈敏度、可實現定量檢測的數字PCR技術具有極大優勢。而多重熒光技術可以對EGFR突變進行多位點聯合檢測，向臨床提供全面信息。

      EGFR基因位于7號染色體短臂7pl2-14區，由28個外顯子組成。其突變主要發生在EGFR酪氨酸激酶的ATP結合位點的編碼區（第18-20外顯子）。目前已經報道大約有30種突變與吉非替尼的藥物反應相關，主要是19外顯子上的缺失突變和21外顯子上的L858R的點突變。外顯子19上747-750位氨基酸的大約20種缺失約占所有突變的45%，外顯子21上L858R的點突變占所有突變的45%左右，外顯子18的3種點突變（G719X）約占5%，外顯子20的突變占1%左右。另外研究發現，外顯子20上的T790M突變與酪氨酸激酶抑制劑藥物的耐藥性相關。
      領航基因公司多色多重數字PCR試劑盒，可高通量聯合檢測EGFR基因18外顯子、19外顯子、20外顯子、21 外顯子上共22種突變位點，特異性強，靈敏度高。
      檢測結果圖示：
      黃色信號簇=背景信號，紅色信號簇=VIC陽性反應孔數，綠色信號簇=ROX陽性反應孔數，藍色信號簇=FAM陽性反應孔數，淺藍色信號簇=CY5陽性反應孔數，淺紫色信號簇=CY7陽性孔數（內參）

      通過T790M位點突變的檢測限實驗結果表明多重數字PCR可檢測到突變豐度低至0.1%，顯示了極高的靈敏度。
      檢測結果圖示：
      黃色信號簇=背景信號，藍色信號簇=FAM陽性反應孔數（790M），淺藍色信號簇=CY5陽性反應孔數（1#染色體內參）

      胎兒染色體非整倍體異常是導致人類不孕不育、流產、胚胎停育及胎兒缺陷的主要原因，最常見的包括21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征等。

      通過對本例正常男性染色體的多重熒光分析（FAM/VIC/Cy5/Cy7），每組同時檢測4條染色體拷貝數，所得定量結果符合預期。

      對領航基因數字PCR系統多重熒光通道精密度的測試顯示，在低拷貝下仍然能夠維持CV在10%左右，具有較高的精密度和準確性。

      根據中國細菌耐藥監測網（CHINET）2018年1-12月的統計數據，在244根據中國細菌耐藥監測網（CHINET）2018年1-12月的統計數據，在244,843株臨床分離菌中來自呼吸道感染的占39.7%，接著是尿液標本（18.8%），血液標本（14.8%）和其他無菌體液等。 
      在97,297株呼吸道分離菌中，占比前八位依次是肺炎克雷伯菌（肺克）、鮑曼不動桿菌（鮑曼）、銅綠假單胞菌（銅綠）、金黃色葡萄球菌（金葡）、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜麥芽窄食單胞菌和大腸埃希菌，這八種菌占呼吸道感染致病菌的80%以上。
      痰液培養是當前呼吸道感染細菌鑒定的主要手段，但存在周期長，標本不合格造成的培養陽性率低等問題。亟需一種方便、準確、快捷的感染細菌鑒別方法，對治療方案的確定非常關鍵。

      領航基因的五色熒光數字PCR系統，每張芯片可以同時檢測4個目標菌株（需要一個熒光通道做內控/內對照）。只用兩張芯片（兩個Panels）就可以涵蓋呼吸道感染最常見的8種感染菌。
      除了檢測目標的8種菌以外，對另外8種常見致病菌的交叉檢測表明，兩個檢測Panel的特異性良好，無非特異交叉擴增信號。下面幾張圖展示了五色五重體系兩個Panel，在目標片段為10copy時的測試結果。所有目標菌的核酸片段均能被正確檢出。


      幾例利用多色多重體系檢測臨床樣本的結果。
      鑒于數字PCR可以直接絕對定量的特性，除了可以用于致病菌的快速鑒定外，還可以用于絕對定量和實時監控，用于評估和及時改進治療方案。
      結束語
      綜上所述，多重熒光數字PCR技術不僅具有高靈敏度、絕對定量、穩定性好的優勢，更進一步滿足臨床多項指標聯合檢測需求，提高通量，節約時間，降低成本，具有非常好的應用前景。